Pendahuluan: Escherichia coli merupakan flora normal usus manusia, pada kondisi tertentu dapat bersifat patogen. Salah satu cara pencegahannya dengan mengonsumsi kombucha. Kombucha daun sirsak merupakan minuman hasil fermentasi rebusan daun sirsak yang mengandung asam organik, etanol, polifenol, dan bakteri asam laktat sebagai antibakteri. Potensi antibakteri kombucha daun sirsak dipengaruhi oleh lama fermentasi. Penelitian sebelumnya menyatakan perlakuan lama fermentasi 7 dan 14 hari menghasilkan total asam dan senyawa fenolik paling tinggi yang mempengaruhi aktivitas antibakteri. Lama fermentasi 12 hari berpotensi sebagai antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh lama fermentasi kombucha daun sirsak terhadap pH dan daya hambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli. Metode: Penelitian eksperimental laboratorium in vitro. Serbuk daun sirsak dan gula pasir dimasukkan kedalam air yang sudah mendidih. Perebusan dilakukan hingga 15 menit dan didinginkan. Kemudian dimasukkan kedalam jar dan ditambahkan kultur kombucha, lalu ditutup dengan kertas tissue. Lama fermentasi kombucha daun sirsak yaitu 7, 14 dan 21 hari. Uji pH diukur dengan pH meter elektrik dan uji antibakteri menggunakana uji Zone of Inhibition (ZOI) dengan metode sumuran. Pengukuran zona hambat menggunakan aplikasi image J. Analisa data menggunakan uji One Way ANOVA yang dilanjutkan dengan uji Least Significance Different (LSD), dengan signifikansi p<0.05. Hasil dan Pembahasan: pH kombucha daun sirsak dengan lama fermentasi 7, 14, dan 21 hari didapatkan 4,16±0,04; 3,17±0,03; dan 2,41±0,01 secara berurutan (p<0.05). ZOI kombucha daun sirsak dengan lama fermentasi 7,14, dan 21 hari didapatkan 14,1±1,92 mm; 10,7±0,57 mm; dan 9,5±0,56 mm secara berurutan (p<0.05). ZOI amoksisilin 10 mg/ml sebagai kontrol adalah 13,7±0,34 mm (p<0.05). Lama fermentasi paling optimum adalah 7 hari karena tidak berbeda siginifikan dengan kontrol. Semakin lama fermentasi pH larutan semakin asam, sehingga menghambat proses penguraian fenol dan metabolisme probiotik dalam menghasilkan bakteriosin, menyebabkan zona hambat cenderung menurun. Kesimpulan: Fermentasi 7 hari pada pembuatan kombucha daun sirsak merupakan waktu terbaik untuk menghasilkan pH yang tidak terlalu asam dan potensi antibakteri Escherichia coli yang kuat. Kata Kunci: Annona muricata L., kombucha daun sirsak, ZOI, Escherichia coli