Pendahuluan: S. aureus merupakan penyebab infeksi nosokomial dan dapat menimbulkan sepsis, sehingga perlu penegakkan diagnosis yang cepat menggunakan metode deteksi berbasis DNA. Ekstraksi DNA yang umum dilakukan adalah berbasis filter (KBF) yang mahal. Alkaline Lysis (AL) merupakan metode ektraksi DNA yang sederhana dan ekonomis, namun tingkat kualitas dan kuantitas ekstrak DNA pada S. aureus masih belum diketahui. Metode: Penelitian eksperimental laboratorium in vitro menggunakan bakteri S. aureus VT003221 untuk mendapatkan ekstrak DNA dengan metode AL dan KBF. Konsentrasi bakteri yang digunakan adalah 108 dan 1012 CFU/ml, dengan LB sebagai kontrol. Hasil ekstrak DNA diuji kualitas dan kuantitas dengan spektrofotometri nanodrop. Data di analisa dan p<0,05 dianggap signifikan. Hasil: Hasil kuantitas tertinggi diperoleh dari metode KBF yaitu 35,40 ± 12,46 µg/ml, sedangkan pada metode AL sebesar 14,20 ± 3,34 µg/ml dari konsentrasi S. aureus 1012 CFU/ml. Pada 108 CFU/ml, kuantitas metode AL adalah 3,80 ± 0,83 µg/ml dan KBF adalah 5,20 ± 1,78 µg/ml. Pada Kontrol, dengan metode AL, didapatkan DNA 0,8 ± 0,44 µg/ml dan 0,0 µg/ml pada metode KBF. Hasil kualitas dari kedua metode ini tergolong baik karena berada pada rentang nilai 1.8 – 2.0, namun pada konsentrasi 108 CFU/ml dari metode AL menghasilkan kualitas yang kurang baik karena didapatkan hasil 1.49 ± 0.16 µg/ml. Kesimpulan: Metode Kit Berbasis Filter menghasilkan ekstrak DNA yang lebih baik secara kualitas dan kuantitas dibandingkan AL dalam mengestraksi DNA s. aureus Kata Kunci: Ekstraksi DNA, Staphylococcus aureus, Alkaline Lysis, Kit Berbasis Filter