Pendahuluan: Kombucha sebagai minuman fermentasi yang bersifat probiotik, yang bahan dasarnya dapat diganti dengan daun sirsak. Salah satu syarat probiotik adalah memiliki aktivitas antibakteri. Daun sirsak telah terbukti memiliki aktivitas antibakteri. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antibakteri kombucha daun sirsak (Annona muricata Linn.) terhadap bakteri Escherichia coli dan Salmonella typhi. Metode: Kombucha daun sirsak di buat dengan merebus 1000 mL air, 100 gram gula pasir dan 5 gram serbuk daun sirsak selama 5 menit. Kemudian di tambahkan 24 gram Symbiotic Culture of Bacteria and Yeast (SCOBY) dan di fermentasi selama 14 hari. Kombucha diambil dan diencerkan pada konsentrasi 25, 50 dan 100% dilakukan uji zona hambat dengan pengulangan 3 kali. Zona hambat diukur dengan metode difusi tipe sumuran. Pengukuran zona hambat menggunakan aplikasi software OptiLab versi 1,5. Analisa data menggunakan uji One Way ANOVA yang dilanjutkan dengan Post-Hoc Tukey dengan signifikansi p <0,05. Hasil dan Pembahasan: Daya hambat kombucha daun sirsak konsentrasi pada 25, 50, 100% terhadap Escherichia coli secara berturut-turut adalah sebagai berikut 7,3±0,9; 9,2±0,8; 12,3±0,3 mm (p=0,05). Sedangkan gentamisin mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli sebesar 14,7±1,2 mm. Sedangkan daya hambat kombucha daun sirsak kosentrasi pada 25, 50, 100% terhadap Salmonella typhi secara berturut-turut adalah 5,23±3,7; 8,47±0,3; 10,36±0,7 mm (p=0,05). Sedangkan gentamisin mampu menghambat pertumbuhan Salmonella typhi sebesar 11,3±1,6 mm. Hal ini terjadi karena kombucha daun sirsak mengandung asam organik (asam asetat, asam glukonat dan asam laktat), etanol, flavonoid dan bakteri asam laktat yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Kesimpulan: Kombucha daun sirsak konsentrasi 100% efektif menghambat Escherichia coli dengan derajat kuat. Sedangkan kombucha daun sirsak konsentrasi 50% efektif menghambat pertumbuhan Salmonella typhi dengan derajat kuat. Kombucha daun sirsak lebih efektif menghambat Salmonella typhi dibandingkan Escherichia coli. Kata Kunci: Kombucha, Annona muricata L, Escherichia coli, Salmonella typhi