Pendahuluan : Resistensi antibakteri masih menjadi permasalahan pada tatalaksana penyakit infeksi. Herbal merupakan bahan alam yang menjadi salah satu alternatif sumber senyawa antibakteri. Ekstrak daun Pulutan mempunyai aktivitas antibakteri, namun senyawa aktif dalam fraksi n-butanol belum pernah dilakukan pengujian. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui senyawa fitokimia dan aktivitas antibakteri fraksi n-butanol daun Pulutan (Urena lobata). Metode : Ekstrak methanol difraksinasi dengan pelarut n-butanol, kemudian dilakukan skrining fitokimia pada hasil fraksinasi. Aktivitas antibakteri fraksi n-butanol terhadap Staphylococcus aureus dilakukan dengan uji Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dengan metode mikrodilusi dan uji Zone of Inhibition (ZOI) dengan metode difusi sumuran sementara Amoxicillin dipakai sebagai antibiotic pembanding. Analisa data menggunkan One way Anova dan dilanjutkan uji Post Hoc dengan nilai signifikansi p<0,05. Hasil : Fraksi n-butanol daun Pulutan mengandung senyawa flavonoid, fenolik, saponin, dan alkaloid. Nilai KHM pada fraksi n-butanol (160.000 ppm) lebih tinggi dibandingkan Amoxicillin (0,46ppm). Fraksi n-butanol dosis 20.000, 40.000 dan 80.000 ppm menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus dengan diameter berturut- turut (0.16±0.10 mm) (0.33±0.19 mm) dan (1.64±0.21 mm) lebih rendah dibandingkan Amoxicillin (41.34±0.24 mm). Simpulan : Fraksi n-butanol daun Pulutan (Urena lobata) memiliki kandungan senyawa aktif fenolik, flavonoid, saponin dan alkaloid. Aktivitas antibakteri fraksi n-butanol daun Pulutan lebih lemah dibandingkan dengan Amoxicillin sebagai antibiotik pembanding. Kata Kunci : daun pulutan., fraksi n-butanol., senyawa aktif., antibakteri., Staphylococcus aureus