Salah satu upaya untuk meningkatkan kualitas pejantan adalah dengan mengumpulkan semen yang akan digunakan untuk proses Inseminasi Buatan (IB). Fraksi ejakulasi merupakan salah satu faktor yang dapat mempengaruhi kualitas spermatozoa segar pada sapi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kualitas spermatozoa segar pada sapi Simmental dan sapi Limousin terhadap berbagai fraksi ejakulasi. Penelitian ini menggunakan semen segar dengan masing-masing sapi berumur 3-4 tahun dan 5-6 tahun. Metode penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial dengan 4 kali ulangan. Pengamatan kualitas spermatozoa dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji F dan uji lanjut Beda Nyata Terkecil (BNT). Hasil penelitian menunjukkan bahwa volume semen memiliki perbedaan yang nyata (p<0,05) terhadap jenis sapi, umur, dan fraksi ejakulasi yang berbeda. Warna, pH, konsistensi dan konsentrasi spermatozoa memiliki perbedaan yang nyata (p<0,05) terhadap fraksi ejakulasi yang berbeda. Motilitas dan abnormalitas spermatozoa tidak memiliki perbedaan yang nyata (p>0,05) terhadap jenis sapi, umur, dan fraksi ejakulasi yang berbeda. Dapat disimpulkan bahwa bangsa sapi dan umur berbeda dapat memberikan pengaruh yang nyata pada volume semen saja sedangkan fraksi ejakulasi dapat memberikan pengaruh yang nyata pada volume, warna, pH, konsistensi dan konsentrasi spermatozoa. Sedangkan jenis sapi, umur, dan fraksi ejakulasi yang berbeda tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap motilitas dan abnormalitas spermatozoa. Kata Kunci : Kualitas Spermatozoa, Sapi Simmental, Sapi Limousin, Fraksi Ejakulasi.