Pendahuluan : Pemanfaatan 30-35% bagian dari kulit buah naga kurang optimal seringkali hanya dibuang sebagai limbah. Buah naga memiliki pigmen antosianin pada kulit buahnya, antosianin dapat digunakan sebagai zat pewarna alternatif untuk mengantikan pewarna sintetis eosin yang bersifat karsinogenik. Penelitian ini bertujuan untuk validasi metode pewarnaan ekstrak kulit buah naga merah pada preparat histologi organ hepar Rattus norvegicus L Metode : Simplisia kulit buah naga di ekstraksi dengan larutan asam sitrat kemudian dibuat tiga konsentrasi pewarna (10%, 25%, 50%,), hematoxylin eosin (Kontrol positif +), dan asam sitrat (kontrol negatif -). Dilakukan pewarnaan pada preparat kemudian preparat diamati dibawah mikroskop trinokuler perbesaran 400 kali dan dilakukan pengamatan deskriptif. Sel hepatosit dihitung menggunakan ImageJ, Uji statistik dilakukan untuk pengamatan deskriptif menggunakan Mann-Whitney (P<0,05) Hasil : Pewarna hematoxylin eosin (HE) memberikan hasil rata-rata pengamatan deskriptif (kejelasan,warna,kontras dan debris) yaitu (2, 2, 2, 2) sedangkan asam sitrat (0,0,0,0). Pewarnaan Eksrak asam sitrat kulit buah naga merah dengan konsentrasi 10% mendapatkan nilai rata-rata pengamatan deskriptif (kejelasan,warna,kontras dan debris) (2, 2, 2, 2), dengan konsentrasi 25% (2, 2, 2, 2), dan dengan konsentrasi 50%(2, 1, 1, 2). Hasil nilai akurasi dibandingkan dengan HE pada konsentrasi 10%, 25% dan 50% didapatkan sebesar (98%,52% dan 89%), Hasil nilai presisi dibandingkan dengan HE pada konsentrasi 10%, 25% dan 50% didapatkan sebesar (17%, 13% dan 19%). Kesimpulan : Ekstrak asam sitrat kulit buah naga merah dapat mewarnai preparat organ hepar Rattus norvegicus L, tetapi kualitasnya lebih rendah dibandingkan pewarna hematoxylin eosin sebagai kontrol pembanding Kata kunci : Pewarna alami, Hylocereus polyrhizus, Hematoxylin eosin, Rattus norvegicus L, Akurasi, Presisi