Pendahuluan: Tempe diketahui memiliki kandungan asam lemak tidak jenuh yang tinggi dan mampu menurunkan kadar kolesterol, namun hal ini tergantung pada jenis kacang yang menjadi bahan utamanya. Tempe kacang merah mempunyai kandungan total lemak yang lebih sedikit dibandingkan tempe kacang tanah dan tempe kacang kedelai. Penelitian bertujuan untuk mengetahui perbedaan kadar lemak, jenis asam lemak dan kolesterol yang terkandung pada masing-masing tempe kacang merah, kacang tanah dan kacang kedelai. Metode: Penelitian menggunakan metode in vitro pada tempe kacang merah, tempe kacang tanah dan kacang kedelai. Kadar lemak diekstraksi menggunakan sokletasi dan n-Heksana sebagai pelarut. Identifikasi jenis asam lemak dengan menentukan bilangan iod dan bilangan penyabunan. Kadar kolesterol ditentukan dengan menggunakan pereaksi FeCl3. Hasil pengukuran dianalisa statistik One Way Anova dengan SPSS. Hasil: Tempe kacang merah memiliki kadar lemak dan kadar kolesterol paling rendah, masing-masing sebesar 1,73% ± 0,87 dan 2,73 ± 0,05 mg/g. Bilangan iod tertinggi sebesar 11,54 g/100g didapatkan pada tempe kacang tanah, sedangkan bilangan penyabunan yang paling tinggi (252,03 mg/g) didapatkan pada tempe kacang merah.. Simpulan: Tempe kacang merah memiliki kadar lemak dan kolesterol lebih rendah dibandingkan tempe kacang kedelai dan tempe kacang tanah. Asam lemak tidak jenuh tertinggi pada tempe kacang tanah dan SCFA (Short Chain Fatty Acid) terdapat pada tempe kacang merah. Kata Kunci: Kacang merah, kacang tanah, kacang kedelai, tempe, lemak, asam lemak, kolesterol