Penggunaan antibiotik secara besar-besaran di masyarakat memicu terjadinya resistensi terhadap bakteri, seperti bakteri Propionibacterium acnes penyebab jerawat. Pengembangan obat-obatan perlu dilakukan khususnya pada tanaman herbal yang memiliki potensi untuk diteliti sebagai sediaan obat jerawat. Salah satu di antara tanaman yang diketahui berpotensi adalah mentimun. Mentimun (Cucumis sativus) merupakan tumbuhan yang tergolong dalam familia Cucurbitaceae dan memiliki kandungan senyawa yang potensial untuk dikembangkan seperti, fenol, flavonoid, dan alkaloid. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada daun mentimun melalui analisis histokimia dan potensi senyawa aktifnya sebagai kandidat obat jerawat secara in silico. Analisis histokimia dilakukan dengan preparasi daun segar melalui sayatan bawah daun dengan cara ditetesi reagen pendeteksi metabolit sekunder (CuSO4, FeCl3, Wagner, AlCl3 & FeCl3+NaCO3) kemudian diamati perubahan warnanya secara mikroskopis. Pengujian in silico bertujuan untuk mengetahui sifat fisikokimia dengan Lipinski rule of five, sifat farmakokinetik Absorbtion, Distribution, Metabolism, Excretion, dan Toxicity (ADME & T) dengan pkcsm online tool dan interaksi senyawa aktif dengan KASIII dan JNK1 sebagai target obat jerawat melalui molecular docking. Software dan webserver pendukung yang digunakan yaitu KNApSAcK, Pubchem, Dr. Duke’s, RCSB PDB, PyRx, Biovia Discovery dan Chimera 1.15. Hasil penelitian histokimia menunjukkan bahwa daun mentimun positif mengandung senyawa metabolit sekunder yaitu terpenoid, flavonoid, alkaloid, tanin, dan fenol. Sedangkan dari analisis in silico diketahui isovitexin, cucurbitacin B & C memiliki sifat fisikokimia yang cukup baik namun sifat farmakokinetiknya hanya isovitexin dan cucurbitacin C yang paling baik. Berdasarkan hasil molecular docking terdapat ikatan asam amino yang sama antara isovitexin dengan kontrol pada receptor JNK1 yaitu pada asam amino Ile:32, Val:40 dan Leu:168 dan didukung dengan nilai RMSD di bawah 2 Å serta nilai binding affinity yang rendah sehingga diprediksi yang paling efektif dalam menghambat JNK1. Namun, ke-empat senyawa aktif diprediksi tidak berpotensi menghambat KASSIII karena tidak adanya ikatan asam amino yang sama dengan kontrol walaupun memiliki nilai RMSD di bawah 2 Å dan nilai binding affinity yang rendah