Penelitian ini dimulai pada bulan November sampai dengan Desember tahun 2020. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh konsentrasi gliserol pada pengencer skim kuning telur terhadap motilitas, viabilitas dan abnormalitas semen beku sapi limousin. Kegunaan penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang pengaruh berbagai konsentrasi gliserol pada pengencer skim kuning telur terhadap motilitas, viabilitas dan abnormalitas semen beku sapi limousin agar dapat memberikan manfaat dalam produsen semen beku. Materi yang digunakan dalam penelitian ini adalah semen beku yang berjumlah 6 straw masing-masing berjumlah tiga ekor dengan 2 kali ejakulasi dari BBIB Singosari. Metode penelitian yang digunakan adalah metode penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap (RAL). Data perbedaan kualitas semen antara perlakuan dianalisis menggunakan uji ANOVA dan apabila terdapat perbedaan dilanjutkan dengan uji Duncan. Variabel respon yang diamati adalah motilitas, viabilitas, dan abnormalitas semen. Berdasarkan hasil analysis of variance menunjukkan bahwa berbagai level gliserol berpengaruh sangat nyata (P<0,01) terhadap motilitas semen beku, tetapi berpengaruh tidak nyata (P>0,05) terhadap viabilitas dan abnormalitas semen beku. Hasil perhitungan uji berganda Duncan diketahui bahwa perlakuan SK-Gliserol 17% (47,02 ± 6,5 %) tidak berbeda dengan perlakuan SK-Gliserol 13% (35,22 ± 11,4) dan SK-Gliserol 15% (42,85 ± 3,3 %), namun perlakuan SK-Gliserol 17% lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan TK-Gliserol 13% dan SK-Gliserol 20%. Rata-rata hasil viabilitas TK-Gliserol 13%, SK-Gliserol 13%, SK-Gliserol 15%, SK-Gliserol 17% dan SK-Gliserol 20% secara berturut-turut yaitu 63.05, 74.12, 66.52, 71.98, serta 59.02 %. Hasil rata-rata abnormalitas semen beku sapi Limousin perlakuan TK-Gliserol 13% (9.13 %), SK-Gliserol 13% (4.33 %), SK-Gliserol 15% (3.73%), SK-Gliserol 17% (6.92 %) dan SK-Gliserol 20% (4.75 %). Kesimpulan pada penelitian ini yaitu perlakuan pengencer skim kuning telur + gliserol 17% dapat melindungi spermatozoa sapi Limousin selama proses pembekuan dengan nilai motilitas lebih baik dibandingkan pengencer tris kuning telur yang ditambahkan gliserol 13% dan pengencer skim kuning telur + gliserol 20%.