Perbaikan fertilitas penting dilakukan melalui peningkatan libido dan kualitas semen sapi pejantan Peranakan Ongole (PO) lokal adaptif sehingga akan dihasilkan pejantan unggul dengan kualitas semen sesuai standar SNI sebagai dasar acuan dalam memilih calon pejantan sebagai sumber semen (semen beku dan pejantan alami) melalui pemberian hormonal. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian hormon GnRH dalam berbagai dosis dan periode waktu penampungan semen terhadap kualitas semen pada sapi pejantan PO. Metode penelitian ini menggunakan 18 sapi pejantan PO. Terdapat tiga macam pemberian GnRH, yaitu A (satu dosis/5,0ml/ternak), B (setengah dosis/2,5ml/ternak), dan C tanpa perlakuan GnRH. Perlakuan GnRH diberikan sekali dengan injeksi intramuskular (IM). Penampungan semen ada dua periode, yaitu 8 dan 16 minggu setelah pemberian GnRH. Variabel yang diamati meliputi volume, keasaman, warna, konsistensi, motilitas massa, motilitas individu, konsentrasi spermatozoa, viabilitas, abnormalitas dan libido. Data dianalis menggunakan analysis of variance (Anova). Hasil penelitian menunjukkan bahwa volume dan pH semen tidak berbeda pada semua perlakuan, namun perlakuan A dengan berbagai periode penampungan menunjukkan warna krem dan konsistensi kental dibandingkan perlakuan B dan C. Motilitas massa dan konsentrasi sperma perlakuan C pada berbagai periode penampungan menghasilkan pada nilai terendah berbeda nyata (p<0,05) dibandingkan perlakuan A dan B, sehingga berpengaruh terhadap total spermatozoa dan total motil spermatozoa. Viabilitas sperma pada satu dosis perlakuan A menghasilkan nilai tertinggi berbeda nyata (P<0,05) dibanding perlakuan B dan C dengan viabilitas spermatozoa 78,42±2,46% (A), 76,14±1,52% (B), dan 65,57±8,26% (C) pada periode penampungan 16 minggu. Namun demikian abnoramalitas sepermatozoa dan libido antara berbagai dosis GnRH dan periode penampungan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05) dibandingkan dengan yang tanpa pemberian GnRH. Berdasarkan penelitian ini disimpulkan bahwa (1) pemberian GnRH pada sapi pejantan PO dengan dosis 2,5 ml dan 5,0 ml dengan periode penampungan 8 dan 16 minggu meningkatkan kualitas spermatozoa dibandingkan dengan tanpa pemberian GnRH, kecuali abnormalitas spermatozoa tidak berbeda, (2) pemberian GnRH dengan berbagai dosis dan periode penampungan mempunyai kualitas semen segar dan libido yang sama dibandingkan dengan sapi PO tanpa pemberian GnRH, dan (3) pemberian GnRH sapi pejantan PO dengan dosis 5,0 ml dengan periode penampungan 16 minggu memenuhi standar kualitas semen untuk prosesing semen beku, dan (4) penampungan semen sapi pejantan PO yang baik berdasarkan pengamatan libido dilakukan pada pukul 09.00 hingga 17.00 WWIB.